帕金森病 (PD) 是最常見的運動障礙，全球約 500 萬人患有帕金森病。這種神經退行性疾病的特征包括運動遲緩、靜止性震顫、姿勢不穩(wěn)和肌肉僵硬。雖然我們仍未*了解PD的原因，但黑質中多巴胺能神經元的退化是該疾病的主要病理特征。目前的藥物療法，例如L-dopa、多巴胺激動劑、單胺氧化酶等，通過更換多巴胺或控制其新陳代謝來進行對癥治療。雖然這些藥物大大提高了病人的生活質量，但它們會隨著病情的發(fā)展逐漸失去功效，還會出現(xiàn)由L-dopa引起的運動波動和運動障礙。盡管大量新的抗帕金森的候選藥物在臨床前研究中取得初步成功，我們對于開發(fā)新的替代藥物的需求依舊不斷增長。
斑馬魚因為體積小、透明度高、對化合物的滲透性高，特別適合大規(guī)模藥物篩選。此外，研究表明斑馬魚多巴胺能系統(tǒng)的組織和功能與哺乳脊椎動物相比更加穩(wěn)定，這使得斑馬魚成為一種實用且經濟的用于測試神經活性化合物作用的動物模型。當斑馬魚幼魚被6-OHDA (6-羥基多巴胺) 影響后，會展現(xiàn)出典型的PD表型特征，即多巴胺能神經元的死亡和運動遲緩。此外，6-OHDA 損傷的斑馬魚對抗帕金森病化合物有反應，因此斑馬魚模型是有效的評估新療法的工具。
為緩解6-OHDA損傷的斑馬魚幼魚的運動障礙以及神經細胞數(shù)量減少的癥狀，本次實驗主要探究三種抗帕金森癥的化合物L-dopa, rasagiline 和 isradipine的作用。我們最終選用了stavudine, tapentadol 和 nabumetone作為帕金森癥的靶向藥。接下來和我們一起來了解實驗過程和研究結果吧。
過程
本次實驗針對測試治療控制進行了優(yōu)化，使用了如圖1所示的劑量反應曲線，將斑馬魚幼魚在受精后在胚胎培養(yǎng)基內長大至第四天，胚胎培養(yǎng)基包含（EM [5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、 0.33 mM MgSO4, pH 7.4]) 以及 1 μM 亞甲基。
在這個發(fā)育階段，斑馬魚兒茶素層能系統(tǒng)已*發(fā)育，血腦屏障 (BBB) 也已經開始發(fā)揮作用。斑馬魚幼魚在受精后的五天內都處于6-OHDA 誘導的多巴胺能損傷環(huán)境中，讓神經毒素*滲透于血腦屏障。
在第六天根據(jù)實驗分組，不同的化合物會加入到幼魚的培養(yǎng)基液中并持續(xù)24小時。我們通過使用諾達思的斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)(DanioVision)來記錄幼魚的自發(fā)運動行為，斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)可以自動跟蹤斑馬魚用于的行為及運動軌跡。幼魚可以在96孔板中自由游動，在10分鐘的晝夜循環(huán)后會進行90分鐘的跟蹤記錄。記錄下的運動軌跡數(shù)據(jù)通過諾達思的動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)進行分析，并且只分析在黑暗期間的游泳行為。根據(jù)諾達思提供的實驗規(guī)章，實驗所測量和分析的數(shù)據(jù)包括總游動距離(mm)、突發(fā)游泳行為 (游動速度大于25mm/s的次數(shù)) 和靜止狀態(tài)。
圖1
結果
結果1
L-dopa, rasagiline 和 isradipine可緩解斑馬魚幼魚運動遲緩
6-OHDA損傷的斑馬魚幼魚從移動總距離的量化上表現(xiàn)出類似運動遲緩的行為，為了進一步表現(xiàn)這種運動損傷，我們計算了幼魚達到逃跑行為的速度次數(shù)(>25mm/s)。這個參數(shù)可以評估運動適應性。在暴露于6-OHDA兩天后受損幼魚與健康幼魚比，爆發(fā)游動和總移動距離都減少了(圖2)。我們還評估了在這個模型中L-dopa能否緩解運動損傷，為了確定有效劑量，將6-OHDA損傷的幼魚與不同濃度的每種化合物進行接觸干預，并勾勒出了劑量反應圖。如圖2。
圖2
結果2
Isradipine可以緩解多巴胺能細胞數(shù)量的減少
我們還探索了L-dopa, rasagiline和isradipine對神經元損失緩解的特性。在用每種化合物以有效劑量干預幼魚后，分析幼魚行為，結果如圖3所示。Isradipine可以緩解6-OHDA損傷的幼魚多巴胺能細胞數(shù)量的減少。相反L-dopa和rasagiline并未在斑馬魚模型中呈現(xiàn)改善疾病的效果。
圖3
結果3
Isradipine 和 amantadine可以減少幼魚的運動障礙樣行為
同樣通過每種化合物以有效劑量干預幼魚后，分析幼魚行為得出，isradipine在0.06μM劑量和amantadine在25 μM劑量時，幼魚的運動障礙樣行為有所緩解。相反L-dopa則未起到作用，如圖4。
圖4
結果4
通過基于表型的篩選來識別具有抗帕金森病潛能的化合物
為了篩選出可以針對帕金森癥緩解運動障礙的化合物，我們對1600種FDA認證的藥品進行了表型測定。1600種FDA認證的藥物中有258 (16%)種藥品在第一輪實驗分析中可以緩解運動障礙 (Fig.5 Table1)，基于預先確定的排除標準再將這些藥物重新定位進行篩選，83 種(32%)藥品被淘汰(Table2)。在第三輪和第四輪的篩選中，有78種(30%)和23種(29%)藥品可以相對來說緩解運動障礙(Table 1)。在經過最后的分析之后，最終確定了三種：stavudine, tapentadol 和 nabumetone，作為*的可以用于未來研究抗帕金森靶向藥的藥品(Table 3)。
圖5
參考文獻
Vaz, Rita L., et al. “Identification of Antiparkinsonian Drugs in the 6-Hydroxydopamine Zebrafish Model." Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 189, 2020, p. 172828.
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